ORGANIZAREA
STUDIULUI În
contextul datelor date prezentate studiul propus este conceput
să:
monitorizeze sportivii în etape diferite de pregatire
şi de
antrenament.
Lotul de studiu a cuprins 15 sportivi
de la Judo, 16
atleţi şi 10 studenţi martor de la
Facultatea de Educaţie Fizică şi
Sport. Cei 16 atleţi au fost aleşi: 10 de la probele
scurte şi 6 de la
probele de anduranţă. Toţi subiecţi
incluşi în studiul de
faţă au
vârsta între 19 - 25 ani şi o vechime
în
sportul de
performanţă de 10 - 17 ani.
Testările au fost
efectuate pe durata a
8 luni reuşind să surprindă toate etapele de
pregătire pentru acelaşi
sportiv: repaus, perioadă de pregătire
fizică generală, perioadă
precompetiţională, perioadă
competiţională.
Pentru
fiecare dintre
subiecţi condiţiile testării au fost
aceleaşi: minim trei testări,
antrenamente după ora 16, recoltarea sângelui
înaintea
antrenamentului şi în primele 5 minute după
acesta.
Analizarea
probelor de sânge s-a efectuat în Laboratorul de
Imunologie
al Spitalului Clinic Universitar " Sf. Spiridon" Iaşi.
Materialul
biologic prelevat pentru analiză utilizează
sângele integral
recoltat prin puncţie venoasă şi preluat pe
heparina ( 50 U/ml.).
Timpul de procesare a probelor a fost în medie de 3,5 ore
şi
în nici un caz nu s-a depăşit 5 ore (tocmai
pentru a evita
eventualele erori în minus prin pierderea
viabilităţii
celulare).
Pe toată durata transpotului probele au fost supuse unei
agitării
blânde pentru a evita posibila coagulare a sângelui.
Procesarea
a inclus recuperarea după o primă centrifugare ( 300
g, 5 minute,) a
plasmei din care au fost efectuate dozările imunoglobulinelor.
A urmat
a doua centrifugare ( 1000 g, 10 minute) pentru eliminarea plachetelor
sanguine. După reconstituirea cu ser fiziologic steril,
suspensia de
elemente figurate a fost supusă centrifugării
în gradient de
densitate (amestec ficoll 400 sodium diatrizoate 9.0g/dL), cu 950 g, 20
minute, pentru recuperarea inelului de celule mononucleare. Aceasta a
fost supusă unei spălări intermediare
în ser fiziologic şi
ulterior redistribuirea în mediu nutritiv standard (RPMI
1640,
10%ser fiziologic) la concentraţia de 104 celule/microL.
Experienţa
noastră anterioară sugerează necesitatea
includerii în
metodologia de lucru a unei etape de estimare a ponderii populatilor NK
atât în probele de sânge cât
şi
în
suspensia celulară destinată analizei
funcţionale.
Aprecierea
activităţii citotoxice a limfociteloe NK a utilizat
ca indicator celule
ţintă K562 marcate radioactiv conform unei tehnici
standard. Această
metoda, în rutină în multe laboratoare
pentru
evaluările NK
este bazată pe deosebita susceptibilitate la liza mediata de
NK a
celulelor MHC-I deficiente. Marcarea celulelor ţintă
a fost făcută
utilizând cromat de natriu (Na
25Cr
2O
2)
în concentraţie de
0,1 mrem/ora, 10%ser fiziologic, tip de 2ore. În aceste
condiţii
celulele supuse cromări preiau pasiv şi
concentrează intracelular
materialul radioactiv. Odată pătruns în
celule , prin
modificarea
stării de oxidare şi prin fixarea la citoschelet,
ionii de crom nu mai
pot fi eliminaţi extracelular decât prin distrugerea
celulelor
marcate. Trei spălări succesive
însoţite de verificările de
activitate gama ale supernatantelor au asigura eficienţa
eliminării
materialului radioactiv extracelular.
Testarea
propriu-zisa a
activităţii NK constă din realizarea unei
serii (triplicat) de
suspensii PBMC + K
562 în gama de
rapoate E/T (efector/ţintă) de
la 100/1 până la 12,/1 în 5-6 puncte de
masură.
Aceste
rapoarte E/T au fost realizate în godee în U ale
plăcilor
standard (NUNC) de 96 puţuri. Volumul de reacţie util
a fost de 250
microlitri. Numărul de K562/godeu a fost standard de 5000 de
celule
ţintă. Amorsarea contactelor intercelulare a fost
realizată prin
precedarea incubării propriu-zise (4ore, 37 grade Celsius, 5%
CO
2)
de o
scurtă centrifugare (100 g, 60 secunde). O serie de godee au
permis
extimarea lizei spontane (Ls) a celulelor K562 (250 microlitri
conţinând numai celule ţintă
cromate) cât şi a
lizei maxime
(LT) posibile (240 microlitri de mediu cultură cu 5000 celule
ţintă şi
cu 10 microlitri soluţie concentat de detergent).
La sfârşitul
timpului de incubare, sedimentarea celulelor a fost asigurată
printr-o
scurtă centrifugare (5 minute 200 g, 4 grade Celsius),
recuperarea unor
aliqote constante din supernatatul reacţiilor (100 microL)
fiind
realizată menajat, pentru fiecare godeu în parte.
Valorile LS
şi
respectiv LT au fost estimate prin măsurarea
radioactivităţii
supernatantelor. Activitatea gama a supernatantelor a fost
realizată
prin măsurarea radioactivităţii la un contor
Wallac 1470 Wizard
Automatic gama Counter. Pentru analiza datelor au fost
reţinute numai
acele testări în care LS este sub 6% valoarea LT.
Activitatea
litică a populaţiilor NK în fiecare caz de
studiu a fost
făcută
prin curbe de liză procentuală a celulelor
ţintă.
Metodologia
standard
atribuie pentru fiecare raport E/T o valoare medie calcualtă
conform
formulei:
Liza % = ( Media CPM E/T - LS
medie) / (LT medie - LS medie) unde:
Liza % = capacitatea
litică a limfocitelor;
Media CPM E/T = media celor
trei valori
înregistrate la recuperarea celulară marcată
radioactiv;
LS
medie = media valorilor citite în cazul lizei spontane;
LT
medie = media valorilor înregistrate la liza totală.
Au
fost reţinute pentru analiză numai acele
estimări în care
valorile medii ale radioactivităţii, din cadrul
triplicatului, au
prezentat un coeficint de variabilitate sub 15%.
continuare
... →
REZULTATE
SI DISCUTIIpublicat
pe MedicinaSportiva.Ro: 25 ianuarie 2010