ORGANIZAREA  STUDIULUI

   În contextul datelor date prezentate studiul propus este conceput să: monitorizeze sportivii în etape diferite de pregatire şi de antrenament.
   Lotul de studiu a cuprins 15 sportivi de la Judo, 16 atleţi şi 10 studenţi martor de la Facultatea de Educaţie Fizică şi Sport. Cei 16 atleţi au fost aleşi: 10 de la probele scurte şi 6 de la probele de anduranţă. Toţi subiecţi incluşi în studiul de faţă au vârsta între 19 - 25 ani şi o vechime în sportul de performanţă de 10 - 17 ani.
   Testările au fost efectuate pe durata a 8 luni reuşind să surprindă toate etapele de pregătire pentru acelaşi sportiv: repaus, perioadă de pregătire fizică generală, perioadă precompetiţională, perioadă competiţională.
   Pentru fiecare dintre subiecţi condiţiile testării au fost aceleaşi: minim trei testări, antrenamente după ora 16, recoltarea sângelui înaintea antrenamentului şi în primele 5 minute după acesta.
    Analizarea probelor de sânge s-a efectuat în Laboratorul de Imunologie al Spitalului Clinic Universitar " Sf. Spiridon" Iaşi.
   Materialul biologic prelevat pentru analiză utilizează sângele integral recoltat prin puncţie venoasă şi preluat pe heparina ( 50 U/ml.). Timpul de procesare a probelor a fost în medie de 3,5 ore şi în nici un caz nu s-a depăşit 5 ore (tocmai pentru a evita eventualele erori în minus prin pierderea viabilităţii celulare). Pe toată durata transpotului probele au fost supuse unei agitării blânde pentru a evita posibila coagulare a sângelui.
   Procesarea a inclus recuperarea după o primă centrifugare ( 300 g, 5 minute,) a plasmei din care au fost efectuate dozările imunoglobulinelor. A urmat a doua centrifugare ( 1000 g, 10 minute) pentru eliminarea plachetelor sanguine. După reconstituirea cu ser fiziologic steril, suspensia de elemente figurate a fost supusă centrifugării în gradient de densitate (amestec ficoll 400 sodium diatrizoate 9.0g/dL), cu 950 g, 20 minute, pentru recuperarea inelului de celule mononucleare. Aceasta a fost supusă unei spălări intermediare în ser fiziologic şi ulterior redistribuirea în mediu nutritiv standard (RPMI 1640, 10%ser fiziologic) la concentraţia de 104 celule/microL. Experienţa noastră anterioară sugerează necesitatea includerii în metodologia de lucru a unei etape de estimare a ponderii populatilor NK atât în probele de sânge cât şi în suspensia celulară destinată analizei funcţionale.
   Aprecierea activităţii citotoxice a limfociteloe NK a utilizat ca indicator celule ţintă K562 marcate radioactiv conform unei tehnici standard. Această metoda, în rutină în multe laboratoare pentru evaluările NK este bazată pe deosebita susceptibilitate la liza mediata de NK a celulelor MHC-I deficiente. Marcarea celulelor ţintă a fost făcută utilizând cromat de natriu (Na₂₅Cr₂O₂) în concentraţie de 0,1 mrem/ora, 10%ser fiziologic, tip de 2ore. În aceste condiţii celulele supuse cromări preiau pasiv şi concentrează intracelular materialul radioactiv. Odată pătruns în celule , prin modificarea stării de oxidare şi prin fixarea la citoschelet, ionii de crom nu mai pot fi eliminaţi extracelular decât prin distrugerea celulelor marcate. Trei spălări succesive însoţite de verificările de activitate gama ale supernatantelor au asigura eficienţa eliminării materialului radioactiv extracelular.
   Testarea propriu-zisa a activităţii NK constă din realizarea unei serii (triplicat) de suspensii PBMC + K₅₆₂ în gama de rapoate E/T (efector/ţintă) de la 100/1 până la 12,/1 în 5-6 puncte de masură. Aceste rapoarte E/T au fost realizate în godee în U ale plăcilor standard (NUNC) de 96 puţuri. Volumul de reacţie util a fost de 250 microlitri. Numărul de K562/godeu a fost standard de 5000 de celule ţintă. Amorsarea contactelor intercelulare a fost realizată prin precedarea incubării propriu-zise (4ore, 37 grade Celsius, 5% CO2) de o scurtă centrifugare (100 g, 60 secunde). O serie de godee au permis extimarea lizei spontane (Ls) a celulelor K562 (250 microlitri conţinând numai celule ţintă cromate) cât şi a lizei maxime (LT) posibile (240 microlitri de mediu cultură cu 5000 celule ţintă şi cu 10 microlitri soluţie concentat de detergent).
   La sfârşitul timpului de incubare, sedimentarea celulelor a fost asigurată printr-o scurtă centrifugare (5 minute 200 g, 4 grade Celsius), recuperarea unor aliqote constante din supernatatul reacţiilor (100 microL) fiind realizată menajat, pentru fiecare godeu în parte. Valorile LS şi respectiv LT au fost estimate prin măsurarea radioactivităţii supernatantelor. Activitatea gama a supernatantelor a fost realizată prin măsurarea radioactivităţii la un contor Wallac 1470 Wizard Automatic gama Counter. Pentru analiza datelor au fost reţinute numai acele testări în care LS este sub 6% valoarea LT. Activitatea litică a populaţiilor NK în fiecare caz de studiu a fost făcută prin curbe de liză procentuală a celulelor ţintă. Metodologia standard atribuie pentru fiecare raport E/T o valoare medie calcualtă conform formulei:

Liza % = ( Media CPM E/T - LS medie) / (LT medie - LS medie) unde:
Liza % = capacitatea litică a limfocitelor;
Media CPM E/T = media celor trei valori înregistrate la recuperarea celulară marcată radioactiv;
LS medie = media valorilor citite în cazul lizei spontane;
LT medie = media valorilor înregistrate la liza totală.

  Au fost reţinute pentru analiză numai acele estimări în care valorile medii ale radioactivităţii, din cadrul triplicatului, au prezentat un coeficint de variabilitate sub 15%.

continuare ...   →   REZULTATE ŞI DISCUŢII

publicat pe MedicinaSportiva.Ro: 7 februarie 2010