Fibra musculara - o abordare bidirectionala

Abstract: Investigatia moleculara a fibrei musculara descopera versatilitatea unitatilor sale contractile reflectata in procesul de conversie care are loc in cadrul spectrului specific al fenotipului de fibra musculara, care este delimitat de tipul I si II. In aceasta privinta s-a demonstrat existenta a trei tipuri predominante I, IIa, IIb de fibra musculara desi descoperirea altor izomeri ai lantului miozininc greu (LMG) largesc acest spectru. Factorul principal care declanseaza si controleaza aceasta transormare a fibrelor musculare, este reprezentat de unitatile de neuroni motorii (NM) si rata diferita de transmitere a impulsului nervos care determina contractia musculara. De asemenea s-au stabilit diferite cai de transmitere a semnalelor la nivel celular implicate in procesul de transmitere a informatiei genetice pentru sinteza proteinelor care formeaza LMG, pompa de calciu din membrana reticulului sarcoplasmatic (PCRS), aparatului enzimatic aerob si anaerob, specific pentru fiecare tip de fibra musculara. Caracterul specific al contractiei in fibrele muculare in timpul exercitiului poate fi de asemenea studiat si prin determinarea procesului de producere si consum a energiei, care are o dinamica determinata de procentajul si activitatea tipului predominant de fibre musculare recrutate in timpul efortului fizic. Rezulta astfel, ca modul de recrutare al fibrelor musculare determinat de durata si intensitatea exercitiului, conditioneaza exprimarea fenotipului de fibre intr-un muschi sceletic.

Cuvinte cheie: lant miozinic greu, neuroni motorii, pompa de calciu din membrana reticulului sarcoplasmatic.

  Cat de repede, pentru cat de mult timp si cat de puternica este contractia muschilor, sunt principalele criterii in functie de care este investigat actul de miscare in sport. Dar aceste calitati psiho-somatice determina o raza vasta a spectrului de miscare a corpului omenesc, formata din ponderea in care fiecare dintre acestea participa in efectuarea miscarii. Existenta mai multor parametrii in cuantificarea miscarilor corpului in sport, in privinta vitezei, intensitatii contractiei si/sau a duratei lor, dovedeste ca musculatura scheletica este capabila sa se contracte si sa sustina diferite tipuri de eforturi fizice determinate de cerintele specifice fiecarui sport. Prin urmare, fibrele musculare trebuie considerate ca unitati versatile care isi adapteaza structura si functia lor moleculara in raspuns la maniera in care muschiul este solicitat. In aceasta privinta a fost stabilita existenta a trei tipuri principale I, IIA and IIB de fibra musculara (4), pe baza tipului de izoformi ai LMG si anume; LMG I, LMG IIa si LMG IIb, identificate in functie nivelul de activitate a enzimei ATPaze (adenozintrifosfataze). Insa fibra musculara scheletica, aproape intotdeauna contine LMG care sunt hibrizi (26). Identificarea acestor multiple tipuri de fibre musculare a fost realizata prin abordari biochimice, histologice si fiziologice, dar rezultatele nu au coincis totdeauna (32).

  Tema acestei lucrari nu este o dezbatere asupra acestor tehnici. Metoda histochimica insa, este discutata aici pentru ca prin aceasta tehnica cel mai intim loc al masinariei contractiei musculare este studiat.

  Apoi se vrea a fi facuta o paralela intre investigatia prin experimente in vitro a structurii si functiei moleculare ale fibrei musculare si rezultatele obtinute prin investigatiile facute inainte, in timpul si dupa terminarea efortul fizic.

Structura moleculara si functionarea masinariei de contractie a fibrei musculare
  In interiorul „cutiei chinezesti”, o interesanta comparatie a structurii grosiere a muschiului scheletic, in care invelisurile externe epimisium, perimisium si endomisium sunt comparate cu cutiile din ce in ce mai mici continute de cutia mare, cele mai importante componente care dicteaza modul de contractie al fibrei musculare in timpul efortului sunt unitatile sale contractile, sarcomerele. Mai mult despre structura grosiera a muschiului scheletic poate fi gasit in literatura de specialitate.
  Detaliind lucrurile, filamentele de actina si miozina care prin venirea repetata in contact in cadrul ciclului de atasara-glisare-detasare reprezinta „miezul” contractiei in fiecare fibra musculara.
  Filamentul subtire, actina, este o proteina a carei structura de baza este formata din doi α polimeri inlantuiti unul in jurul celulilalt in forma unei suvite. Aceasta structura este de asemenea numita F actina. Doua lanturi α elicoidale infasurate la fel, unul in jurul celuilalt, formeaza tropomiozina care se intinde de-a lungul santului format de inlantuirea polomerilor de actina. In continuare, troponina, un heterotrimer (troponin T, troponin C si troponin I) este al treilea component al complexului in interiorul caruia intereactiunile coordonate ale moleculelor de actina, tropomiozina si troponina permit si influenteaza ciclul de reactiuni ale filamentelor de actina si miozina (Fig 1 si 3).

Fig 1. Complexul de troponina si locurile de atasare a capetelor LGM (punctele albe ale moleculelor verzi de actina) expuse prin reactia ionilor de calciu cu subunitatea troponin C. (desen preluat din Elsevier Ltd. Boron & Boulpaep:Medical Physiology, Updated Edition)

Structura filamentului gros de miozina, ca si actina prezinta a structura polimerica. O molecula de miozina este un hexamer format din doua lanturi grele reprezentate la fel de doua structuri α elicodale infasurate unul in jurul celulilalt, spre stanga si care se termina fiecare cu capul, formatiune constituita din 850 de aminoacizi, prin care miozina se ataseaza de filamentul de actina (3). Acesta reprezinta de asemenea si locul in care are loc hidroliza ATP-ului, activitatea ATPazica. Structura elicoidala care se desprinde din acest domeniu, reprezinta legatura pentru lanturile usoare esentiale si regulatoare (Fig 2), care de asemenea participa la reactia dintre actina si miozina.
   In timpul ciclului de reactii dintre filamentele de actina si miozina, prinderea unei molecule de ATP (adenozintrifosfat) detaseaza capul LGM . In continuare hidrolizarea ATP-ului permite capului miozining sa se prinda din nou fibra de actina. Concomitent cu eliberarea gruparii fosfat (Pi) a ATP-ului, se produce si o schimbare in forma si structura capului miozininc asemanatoare unei miscari de pendulare care odata realizata, duce la scurtarea muschiului datorita glisarii filamentelor de actina si miozina (Fig 3). Un ciclu este terminat atunci cand de locul de prindere al nucleotidei (ATP) este atasata DOAR o molecula de ADP (adenozindifosfat). Eliberarea ulterioara a moleculei de ADP lasa moleculele de actina si miozina atasate unele de altele

Identificarea tipurilor de fibra musculara bazata pe metoda histochimica si izoformi LGM.

  Marcarea histochimica a fibrelor musculare pentru determinarea nivelului de activitate a ATPazei miozinice, a fost mult timp cea mai utilizata metoda in clasificarea fibrelor musculare in fibre de tip I, IIA si IIB. Aceasta tehnica se bazeaza pe expunerea capului miozinic la diferite nivele ale pH-ului dupa care preparatul muscular este incubat in prezenta Ca2+ si ATP-ului (4). In functie de cat de mult aceasta aciditate variata a afectat locul de prindere a ATP-ului (structura sa conformationala), activitatea ATPazica s-a observat a fi diferita in tipurile de fibre musculare care alcatuiesc muschiul.

Fig 2. Structura moleculara a filamentului gros de miozina. In figura sunt prezentate lanturile grele de miozina care se termina fiecare cu capul, de care atasate, se pot observa subunitatile esentiale si regulatoare (desen preluat din Elsevier Ltd. Boron & Boulpaep:Medical Physiology, Updated Edition)

Fig 3. Actiunea ionilor de calciu asupra subunitatii troponin C rezulta in expunerea locurilor de prindere a capurilor miozinice si astfel in cuplarea actinei cu miozina. (desen preluat din Elsevier Ltd. Boron & Boulpaep:Medical Physiology, Updated Edition)

Prin urmare, s-a observat ca activitatea ATPazica in fibrele musculare de tipul I nu este afectata de un pH cuprins intre 3.9 si 10.4. Tipul IIA de fibra musculara a prezentat o activitate ATPazica care a fost inhibata de un pH mai mic de 4.9 si mai mare de 10.8 in timp ce in tipul IIB de fibre, hidroliza ATP-ului nu a fost afectata de diferitele niveluri de aciditate cuprinse intre 4.5 si 10.8 pH. Totusi trebuie observat ca aceasta tehnica nu masoara viteza de hidrolizare a ATP-ului in capul miozininc, care de altfel a fost gasita a fi de 2-3 ori mai mare in tipul II de fibre musculare (35). Mai recent, prin folosirea acestei metode s-au identificat mai multe tipuri de fibre musculare IC, IIC, IIAC si IIAB care poseda activitate miozin- ATPazica intermediara (32). Studierea izomerilor LGM din fibrele musculare, de asemenea permite clasificarea tipului acestora. Chiar daca, izomerii LGM sunt identificati prin analize imunohistochimice in care sunt folositi diferiti compusi chimici cum ar fi anticorpi antimiozinici sau gelul de sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pentru electroforeza (SDS-PAGE) separation (25), acestia corespund celor trei tipuri de fibre musculare identificate pe baza activitatii ATPazice mentionate inainte. Acest lucru este normal pentru ca LGM contin partea structurala in care are loc activitatea ATPazica. Cu exceptia izomerului LGMx corespondent al tipului IIB de ibra musculara, notarea izomerilor tipului IA si IIA este asemanatoare (tabel 1). Muschiul scheletic de origine umana nu prezinta izomerul tipului II de fibra musculara notat LGMIIb (15).
   In ceea ce priveste lanturile usoare de miozina, s-a dovedit de asemenea ca si acestea pot exista sub forma mai multor izomeri, care afecteaza proprietatile contractile ale fibrei (34).

Dinamica transformarii tipului de fibra musculara

O caracteristica foarte importanta a fibrei musculare este capacitatea ei de a se adapta la diferitele solicitari functionale ale zilei. Aceasta capacitate este reflectata de plasticitatea fibrei musculare care presupune conversia intre tipurile principale de fibre descoperite. Cel mai comun tip de conversie musculara a fost descoperit a avea loc intre tipul IIB si IIA (1, 26), dar si o crestere a expresiei izomerului LGM IIa legata de transformarea bidirectionala dinspre izomerii LGM I si LGM IIx poate fi posibila (1). O scadere in manunchiul tipului I de fibra musculara printr-o puternica conversie a acestora in tipul II, a fost observata a fi cauzata de o accentuata si rapida scadere a formei fizice sau accidente ale coloanei vertebrale (29).

ATPase - stained	Myosin heavy chain
Fiber type	Isoforms
I	LGMI
IIA	LGMIIa
IIB	LGMx

Promotori ai diferitelor fenotipuri de fibre musculare
Natura plastica a fenotipului de fibra musculara s-a de descoperit a fi determinata de variatiile in activitatea motoneuronilor (26, 27, 37). Principalul efect al stimularii neuromusculare este cresterea concentratiei intracelulare a Ca2+, dar mecanismul prin care aceasta poate fi legatura dintre activitatea motoneuronilor si procesul de translatie a genelor este inca dezbatut. Totusi, cativa dintre promotorii procesului transcriptional implicati in special in expresia genelor pentru cele doua tipuri I si II de fibra musculara au fost identificati. Prin urmare calea dependenta de calcineurin in transmitere semnalelor procesului de translatie, s-a descoperit a fi cea controleaza expresia genelor in fibrele musculare de tipul I (5). Mecanismul propus pentru aceasta consta in controlul direct exercitat de calcineurin asupra fosforilarii factorului nuclear al proteinei activate (NFAT) si translocarii acestuia nucleului. Aceasta, in continuare, impreuna cu factorul miogen de imbunatatire (MEF2) care de asemenea raspunde la multiplele semnale regulatoare ale calcineurinei si altor proteine, cauzeaza activarea proteinelor tipului I de fibra musculara care urmeaza a fi sintetizate (39). Calea de treansmitere a semnalelor care implica proteina Ras (face parte din grupul proteinelor G) si proteina activatoare de mitogen kinaza a fost de asemenea descoperita influentand generarea tipului I de fibra musculara (24). Proteina calmodulin kinaze a carei activitate depinde de concentratia Ca2+ este de asemenea influentata de o rata scazuta de transmitere a impulsurilor nervoase la nivelul motoneuronilor (39). Factorul de coactivare 1 alfa care actioneaza asupra receptorului γ si este activat de peroxisom proliferator, activeaza transcriptia in cooperatie cu proteinele MEF2 si serveste ca „tinta” pentru semnalele declansate de calcineurin, care asa cum a fost mentionat inainte este implicata in exprimarea genelor implicatate in formarea fibrelor de tipul I (21).
  Schimbarea in natura predominanta a efortului de la aerobioza catre productia anaeroba de energie, este insotita de un raspuns corespunzator in controlul procesului translational.In studiul lui Grifon et al (2004), administrarea de Six 1 (factor nuclear implicat in procesul translational cu rol in proliferarea celulelor) si factorul sau de activare Eya 1 fibrelor de tipul I continute de muschiul soleus, a determinat proliferarea enzimelor glicolitice endogene si proteinele sarcomerice specifice tipului II de fibra musculara, concomitent cu reducerea exprimarii genelor specifice tipului I. Alt regulator important in exprimarea genelor tipului II de fibra musculara s-a descoperit a fi factorul – 1α care induce hipoxia. Accentuarea proliferarii acestuia a fost asociata cu intensificarea adaptarilor celulare specifice producerii ATP-ului in conditii de hipoxie, reflectate in cresterea continutului enzimatic specific sistemului fosfagen si glicolitic (23). Prin urmare, recrutarea mai multor fibre musculare de tipul II in timpul eforturilor maximale si supramaximale nu poate fi doar accidental asociata cu conditiile de hipoxie existente la nivelul muschilor pe durata acestor eforturi.
  Se poate spune ca principalul factor temporar care afecteaza expresia genelor in sinteza proteinelor contractile ale muschiului, este dinamica concentratiei intracelulare a Ca­2+. Cum ciclul interactionarilor dintre actina si miozina are loc ca urmare a reactiei ionilor de calciu cu troponina in expunerea locurilor de prindere a capetelor miozinice, rezulta ca modul de eliberarea a ionilor de calciu in raspuns la excitatia neuromusculara, trebuie sa fie mediata printr-o activitate diferita in pompele de Ca2+ existente in membrana reticului sarcoplasmatic. Astfel, s-a descoperit ca PCRS se gaseste sub forma a trei izomeri (22), dintre care izomerul PCRS 1 este exprimat mai mult in fibrele de tipul II, in timp ce PCRS 2 este mai abundent in tipul I de fibre musculare.
  In concluzie, poate fi spus ca modul diferit in care fibrele musculare ale muschiului scheletic se pot contracta, este determinat de activitatea motoneuronala care declanseaza raspunsul transcriptional corespunzator. Acesta vizeaza nu numai exprimarea genelor specifice izomerilor LGM dar si aparatelor enzimatice glicolitice si/sau oxidative cat si izomerilor PCRS.

Examinarea macromoleculara a fenotipului de fibra musculara

  Consta in evidentierea descoperirilor legate de structura si modul de functionare al fibrei musculare la nivel molecular folosind evaluarea comportamentului muschilor scheletici in timpul exercitiului, prin diferite metode si proceduri care sunt mai putin invazive si care furnizeaza informatii (rezultate) mai rapid.
  Cea mai folosita modalitate de identificare a tipului predominant de fibre musculare recrutate in timpul contractiei este determinarea intensitatii si vitezei de contractie si a circuitului corespunzator de producere si consum a energiei. Producerea si consumarea energiei in muschi in tipul efortului poate fi determinata fie prin abordare metabolica sau calorimetrica (38). Abordarea metabolica presupune insumarea producerii aerobe si anaerobe de energie in muschii angajati in efort, in timp ce metoda calorimetrica consta in masurarea producerii de caldura (variatia temperaturii la nivelul muschilor) si a energiei corespunzatoare lucrului mecanic efectuat. Prin studii in vitro, bazat pe costul energetic determinat de contractii tetanice scurte (6), pe continutul in ATP si fosfocreatina care s-a descoperit ca este proportional cu viteza de contractie (7), si pe baza calduri eliberata in timpul contractiei (2) s-a stabilit ca viteza de contractie in tipul II de fibra musculara este mai mare cu pana la 3 sau 5 ori in comparatie cu tipul I.
  In conformitate cu rezultatele acestor minutioase studii, s-a observat ca adaptarile, sau mai precis spus reactiile fiziologice care au loc in corpul omenesc in timpul exercitiului fizic la diferite intensitati ale efortului, difera. In acesta privinta s-a observat ca cinetica absorbtiei oxigenului in timpul eforturilor intense prezinta o a treia componenta, numita componenta lenta, indicand un consum mai mare de oxigen datorita unei mai mari recrutari de fibre musculare de tip II (19, 28). Aceasta se datoreaza continutului scazut de mitocondrii, si in general echipamentului enzimatic aerobic, care le fac sa aiba o eficienta mai scazuta in refosforilarea nucleotidelor (ATP, ADP si AMP adenozinmonofosfat) pe baza consumului de oxigen (16, 18). Mai mult, traseul alfa-glicerolfosfat implicat in transportul nicotin-adenine-dinucleotidei (NAD) prin care se realizeaza transferul ionilor de hidrogen in mitocondrii, s-a descoperit a fi prezent mai mult in tipul II decat in tipul I de fibra musculara. Aceasta este o alta explicatie a eficientei scazute in producerea aeroba de energie in tipul II de fibre, stiut fiind ca, aceasta cale de transport introduce ionii de hidrogen in mitocondrii la un nivel mai jos decat primul complex al lantului respirator, determinand deci o refosforilare mai redusa a ADP-ului (31). Pe langa acestea, expresia in membrana mitocondriala a proteinei numita UCP 3 (uncoupling) care cauzeaza decuplarea pomparii ionilor de hidrogen din matrice in spatiul intermembranos mitocondrial de refosforilarea ADP-ului, efect ce rezulta in cresterea producerii de caldura si scaderea productiei de ATP (scaderea P/O) in tipul exercitiului, este mai accentuata in tipul II decat in tipul I de fibre musculare (14). Prin urmare, poate fi spus ca activarea diferita a fibrelor printr-o crestere a recrutarii tipului II in timpul efortului ar putea mari costul metabolic al contractiei si prin urmare sa scada eficienta mecanica.

Fig 4. Modul de recrutare al tipului I (patratelele goale), IIa (patratelele pline) si IIb (trinughurile pline) de fibra musculara, exprimat in functie de rata de inervare a fibrei musculare si intensitatea contractiei; figura este realizata pe baza datelor din Hannerz 1974

  Estimarea golirii rezervelor de glicogen din muschi in timpul exercitiului a aratat ca efectuarea eforturilor mai intense au fost strans corelata cu un consum mai marit de glicogen predominant in fibrele musculare de tip II (9, 36).
  Productia de ATP pe baza sistemului fosfagen imediat, adica, defosforilarea fosfatului de creatina (Fc), s-a stabilit a fi mai mare in fibrele de tipul II in timpul exercitiilor intense (30, 33). Acest lucru este explicabil, pentru ca acesti metaboliti ( Fc si glicogenul) au fost descoperiti a fi continuti in cantitati mai mari in tipul II de fibra musculara.
  Se stie ca eliberarea lactatului din celula musculara creste in paralel cu intensitatea efortului. Un fapt interesant constatat, este acela ca, doi dintre principalii transportatorii monocarboxilici de lactat (TML) care se afla in membrana celulara, au proprietati diferite in ceea ce priveste viteza de reactie. Izomerul TML4 care se gaseste predominant in membrana fibrelor musculare de tip II are o mare constanta de disociere (prinde usor substratul, molecula de lactat, dar se disociaza mai greu de ea), avand Km (constanta Michaelis) de 20-35mM, in timp ce pentru TML1 prezent mai mult in membrana fibrelor de tipul I, Km este de 3-5mM (11, 20). Aceasta arata de asemenea abilitatea dar si predispozitia fibrelor musculare de tipul II de a produce si folosi energia in mod anaerob, si asa cum a fost mentionat mai inainte, acest lucru faciliteaza viteza mai mare de contractie a muschiului.
  Prin folosirea biopsiilor musculare este posibil aprecierea schimbarilor survenite in procentul de exprimare in muschi, al fiecarui tip de fibra musculara, al marimii sectiunii transversale a acestuia, precum si al nivelului de capilarizare, care au fost influentate de natura protocolului urmat in cadrul experimentului.
Acestea toate, impreuna, indica existenta unui anume mod de recrutare al fibrelor musculare in timpul efortului, in concordanta cu care, tipul I de fibre care au un prag mai scazut al declansarii potentialelor de actiune sunt recrutate la intensitati reduse, in timp ce in tipul II, contractia fibrelor este determinata de intensitati mai mari ale efortului (13, 17) (Fig 4).
  Devine interesanta ideea de a face o paralela intre descoperirile facute in urma studiilor si analizelor facute in laborator si aprecierile facute cu ochiul liber,in privinta corespondentei dintre viteza si/sau intensitatea contractiei si consumul de oxigen sau frecventa cardiaca,cand masurarea consumului de oxigen nu este posibila, stiut fiind ca exista o stransa relatie intre nivelul consumului de oxigen si cel al frecventei cardiace (8). Cu siguranta completarea acestora cu masuratori ale variatilor de metaboliti in sange si muschi, vine si imbunatateste acuratetea masurarii gradului de implicare in ceea ce priveste recrutarea si nivelul de activare al celor trei grupe principale de fibre musculare in timpul efortului.

Bibliografie

1. Andersen J.L., Klitgaard H. and Saltin B. (1994) Myosin heavy chain isoforms in single fibers from m. vastus lateralis of sprinters: influence of training. 151: 135-142.

2. Barclay C.J., Constable J.K. and Gibbs C.L. (1993). Energetics of fast and slow-twitch muscles of the mouse. J Physiol (Lond) 472:61-80.

3. Berg.J.M. Tymoczko J.L.Stryer L.(2003). Biochemistry 5th edtition

4. Brooke M.H. and Kaiser K.K. (1970). Three myosine adenosine triphosphate systems: the nature of their pH lability and sulfhydryl dependence. J Histochem Cytochem 18(9):670-672

5. Chin E.R., Olson E.N., Richardson J.A., et al (1998) A calcineurin-dependent transcriptional pathway controls skeletal muscle fiber type. Genes Dew 12: 2499-2509.

6. Crow M.T. and Kushmeric M.J. (1982). Chemical energetics of slow and fast-twitch muscles of the mouse. J.Gen Physiol 79:147-166.

7. Di Prampero P.E., Boutellier U. and Marguerat A. (1988). i>Efficiency of work performance and contraction velocity in isotonic tetani of frog sartorius. Pflügers Arch 412:455-561.

8. Esposito F., Impellizzeri F.M., Margonato V., Vanni R., Pizzini G., Veicsteinas A. (2004). Validity of heart rate as an indicator of aerobic demand during soccer activities in amateur soccer players. Eur J Appl Physiol 93 (1-2): 167-172.

9. Gollnick P.D., Piehl K. and Saltin B. (1974). Selective glycogen depletion pattern in human skeletal muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedaling rate. J Physiol (Lond) 241:45-57

10. Grifone R., Laclef C., Spitz F. et al (2004) Six 1 and Eya 1 expression can reprogram adult muscle from slow-twitch phenotype into the fast-twitch phenotype. Mol Cell Biol 24: 6253-6267.

11. Hallestrap A.P. and Meredith D. (2004) The SLC16 gene family-from monocarboxylate transporters (MCTs) to aromatic amino acid transporters and beyond. Pflűgers Arch 447: 619-628.

12. Hannerz J (1974) Discharge properties of motor units in relation to recruitment oreder in voluntary contraction. Acta Physiologica Scandinavica 91: 378-384.

13. Henneman E., Somjen G. and Carpenter D.O. (1965). Functional significance of the cell size in spinal motorneurons.J Neurophysiol 28:560-580

14. Hesselink M.K., Greenhaff P.L., Constantin-Teodosiu D., Hultman E., Saris W.H., Nieuwlaat R., Schaart G., Kornips E. and Schrauwen P. (2001). Protein expression of UCP3 differs between human type 1, type 2a, and type 2b fibers. FASEB J 15(6):1071-1073.

15. Hilber K., Galler S., Gohlsch B. and Pette D. (1999) Kinetic properties of myosin chain isoforms in single fibers from human skeletal muscle. FEBS Lett. 455: 267-270.

16. Hoppeler H., Hudlicka O. and Uhlmann E. (1987). Relationship between mitochondria and oxygen consumption in isolated cat muscles. J Physiol. Lond. 385:661-675

17. Houtman C.J., Stegeman D.F., Van Dijk J.P. Zwarts M.J. (2003) Changes in muscle fibers conduction velocity indicates recruitment of distinct motor unit populations J Appl Physiol 95: 1045-1054.

18. Jackman M.R. and Willis W.T. (1996). Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. Am J Physiol 270:C673-C678.

19. Jones A.M., Campbell I.T. and Pringle J.S.M. (2004). Influence of muscle fibre type and pedal rate on the VO₂ – work rate slope during ramp exercise. Eur Journal of Appl Physiol, 91(2-3), 238-245

20. Juel C and Halestrap A.P. (1999) Lactate transport in skeletal muscle: role and regulation of the monocarboxylate transporter. J Physiol 517: 633-642.

21. Lin J., Wu H., Tarr P.T. et al (2002) Transcriptional co-activator PGC-1 alpha drives the formation of slow twitch muscle fibers. Nature 418: 797-801.

22. Lytton J., Westlin M., Scott E.T. et al (1992) Functional Comparisons between Isoforms of the Sarcoplasmic or Endoplasmic Reticulum family of Calcium Pumps. Journal of Biol Chem 267: 14483-14489.

23. Mason S.D., Howlet R.A., Kim M.J. et al (2004) Loss of skeletal muscle HIF-1α results in altered exercise endurance. PLos Biol 2: c288.

24. Murgia M., Serrano a., Calabria e., Pallafacchina G. et al (2000) Ras is involved in nerve-activity dependent regulation of muscle genes. Nat Cell Biol 2: 142-147.

25. Pette D., Peruker H. and Staron R.S. (1999) The impact of biochemical methods for single muscle fiber type analysis. Acta Physiol Scand 166: 261-277.

26. Pette D. and Staron R.S (1997) Mammalian skeletal muscle fiber type transition. Int Rev Cytol 170: 143-223.

27. Pette D. and Vrbova G. (1992) Adaptation of mammalian skeletal muscle fibers to chronic electrical stimulation. Rev Physiol. Biochem. Pharmacol 120: 115-202.

28. Pringle J.S., Doust J.H., Carter H., Tolfrey K. and Jones A.M. (2003). Effect of pedal rate on primary and slow-component oxygen uptake

responses during heavy-cycle exercise. J Appl Physiol 94(4):1501-1507.

29. Roy R.R., Talmadge R.J., Hodgson J.A. et al (1999) Differential response of fast hindlimb extensor and flexor muscles to exercise in adult spinalized cats. 22: 230-241.

30. Sahlin K., Sönderlund K., Tonkonogi M. and Hirakoba K. (1997). Phosphocreatine content in single fibres of human muscle after sustained submaximal exercise. Am J Physiol 273:C172-C178

31. Schantz P.G. and Henriksson J. (1987) Enzyme levels of the NADH shuttle systems: measurements in isolated muscle fibers from humans of differing physical activity. Actpa Physiol Scand 129: 505-515.

32. Staron R.S. (1997) Human skeletal muscle fiber types: delineation, development and distribution. Can J Apply Physiol 22: 307-327.

33. Sönderlund K. and Hultman E. (1991). ATP and phosphocreatine changes in single human muscle fibres following intense electrical stimulation. Am J Physiol 261:E737-E741.

34. Talmadge R.J., Roy R.R. and Adgerton V.R. (1993) Muscle fiber types and function. Curr Opin Rheumatol 5: 695-705.

35. Taylor A.W., Essen B. and Saltin B. (1974) Myosin ATPase in skeletal muscle of healthy men. Acta Physiol Scand 91: 568-570.

36. Vøllestad N.K. and Blom P.C. (1985). Effect of varying exercise intensity on glycogen depletion in human muscle fibers. Acta Physiol Scand 125 (3):395-405.

37. Williams R.S. and Neufer P.D. (1996) Regulation of gene expression in skeletal muscle by contractile activity. The Handbook of Physiology: Integration of motor, Circulatory, Respiratory and Metabolic control during exercise. American Physiology Spciety, Bethesda, MD, pp 1124-1150.

38. Woledge R.C. (1998). Techniques for muscles energetics. Current Methods in Muscle Physiology. ed. Sugi H, Oxford University Press

39. Wu H., Naya F.J., McKinsey T.A., Mercer B., et al (2000) MEF2 responds to multiple calcium-regulated signals in the control of skeletal muscle fiber type. EMBO Journal 19: 1963-1973